圖1. 安揚(yáng)激光FemtoNLTM -920 nm-1光纖激光器

首先，扼要介紹920 nm飛秒激光器在生物成像方面的應(yīng)用。超快激光器是生物成像的理想工具，具有高的峰值功率和低的瞬時(shí)光通量，因此能有效避免損壞被觀測(cè)細(xì)胞。伴隨著1990年W. Denk等制造出了第一臺(tái)雙光子掃描熒光顯微鏡[1]，雙光子顯微成像技術(shù)在生物成像領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展。相對(duì)于現(xiàn)有成熟的共聚焦成像，雙光子顯微成像具有其明顯優(yōu)勢(shì)：成像的深度。特別是在生物組織中，雙光子顯微成像術(shù)由于使用近紅外波長(zhǎng)激發(fā)，減小了對(duì)生物樣品的光損傷，并增加了樣品的穿透深度（圖2）。共聚焦成像一般能做到200 μm的深度，而在活體生物組織中雙光子成像可達(dá)到750 μm的深度，甚至到1 mm。假如是做過透明化處理的組織，雙光子也可以做到4 mm-8 mm的成像深度。

圖2. 共聚焦成像與雙光子成像效果對(duì)比

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)生物成像僅需考慮少量熒光蛋白的吸收峰波長(zhǎng)去激發(fā)即可。常用到的是綠色熒光蛋白的衍生物eGFP[2]，在波長(zhǎng)為920 nm的雙光子吸收條件下激發(fā)eGFP的效率最高，充分滿足雙光子生物成像的要求，如圖3所示。

盡管鈦寶石激光器在700 nm~1100 nm可寬帶調(diào)諧，但對(duì)生物成像的波長(zhǎng)利用率太低。而且鈦寶石激光器價(jià)格高昂，投入動(dòng)輒超過百萬；加之采用空間獨(dú)立元件和水冷，鈦寶石激光器的體積過大，不便于集成到小型的成像系統(tǒng)中。

與之對(duì)比，光纖激光器的性價(jià)比高、體積小巧、無須水冷，其全光纖化的特質(zhì)更有利集成于成像系統(tǒng)中。因此，920 nm的飛秒光纖激光器是生物成像的一個(gè)理想選擇。

圖3. 主要熒光蛋白的雙光子吸收譜

2019年，T.Hellerer等研究了920 nm光纖激光器在生物樣品體外多光子顯微術(shù)中的適用性[3]。實(shí)驗(yàn)證明，920 nm超快光纖激光器作為激發(fā)光源的多種非線性成像術(shù)，如雙光子激發(fā)熒光成像術(shù) (TPEF)，二次諧波成像術(shù)（SHG）和受激發(fā)射損耗熒光成像術(shù)（STED）等，在更深的穿透深度、無標(biāo)簽成像能力或更高的空間分辨率方面，已超越傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)。

圖4. 雙光子激發(fā)熒光顯微成像的效果對(duì)比，920 nm（A）和780 nm（B）

圖5. 采用920 nm光源的雙光子激發(fā)熒光顯微術(shù)可應(yīng)用于不同標(biāo)簽

S. pneumoniae bacteria labeled with ATTO425(A), Human stem cell with ATTO594 labeled actin and DAPI labeled nucleus(B)

隨著在眾多領(lǐng)域的應(yīng)用實(shí)踐，此類顯微鏡將向手持型[4]，插入型[5]等小型化的方向發(fā)展，這將推動(dòng)雙光子成像技術(shù)在術(shù)中腫瘤檢測(cè)、癌癥預(yù)防等醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用。

安揚(yáng)激光推出的這款FemtoNLTM -920 nm-1光纖激光器，是一種多功能的光學(xué)利器，不僅能滿足生物成像方面的科研需求，還在生物學(xué)、物理學(xué)、應(yīng)用科學(xué)、半導(dǎo)體計(jì)量學(xué)和材料加工等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

1. Denk W, Strickler J H, Webb W W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J]. Science, 1990, 248(4951):73-76.

2. Stearns, T., “Green flourescent protein: the green revolution,” Current Biology, 1995, 5(3):262-264.

3. Hellerer T, Polzer C, Friedenauer A,et al. 920-nm fiber laser delivering 100-fs pulses for nonlinear microscopy[C]//Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIX. International Society for Optics and Photonics, 2019, 10882: 108820U.

4. Sherlock B, Warren S C, Alexandrov Y,et al. In vivo multiphoton microscopy using a handheld scanner with lateral and axial motion compensation[J]. Journal of biophotonics, 2018, 11(2): e201700131.

5. Levene M J, Dombeck D A, Kasischke K A, et al. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue[J]. Journal of neurophysiology, 2004, 91(4): 1908-1912.