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挑戰(zhàn)

Mark Miller 博士是位于圣路易斯的華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院體內(nèi)成像中心的副教授兼主任，他在制造和使用多光子顯微鏡方面有著豐富經(jīng)驗(yàn)，尤其是該技術(shù)在活體免疫研究中的應(yīng)用。 這包括對(duì)白細(xì)胞運(yùn)輸和抗原呈遞的里程碑式研究，以及計(jì)算生物學(xué)的新用途。例如，他的團(tuán)隊(duì)首先揭示了涉及APC（抗原呈遞細(xì)胞）靶標(biāo)的 T 細(xì)胞群并不是由趨化因子梯度支配，而是以隨機(jī)運(yùn)動(dòng)開(kāi)始（Miller 等人，Science，2002 年；Miller 等人，PNAS，2004 年；Miller 等人，JEM，2004 年）。

自 2012 年以來(lái)，他還擔(dān)任體內(nèi)成像核心部門(mén)的主任。在該部門(mén)，他建造了一個(gè)通用型多光子顯微鏡，向跨學(xué)科研究人員開(kāi)放，用于傳染病體內(nèi)研究的單細(xì)胞成像。 建造這個(gè)顯微鏡的關(guān)鍵是需要兩路獨(dú)立可調(diào)的激光（Zinselmeyer 等人，Methods Enzymology，2009 年），以實(shí)現(xiàn)使用多個(gè)熒光團(tuán)的靈活實(shí)驗(yàn)。 還需要激光器使用方便，可靠性高，從而極大滿足多用戶使用的需求。

解決方案

圖 1. WashU IVIC 定制雙光子系統(tǒng)

Miller 博士最終選擇對(duì)一臺(tái)市售顯微鏡進(jìn)行修改，為其配備了兩臺(tái) Chameleon Vision II 激光器，部分原因是他之前在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用過(guò) Chameleon Ultra 激光器，有豐富的使用經(jīng)驗(yàn)。他補(bǔ)充說(shuō)，他選擇 Vision II 是因?yàn)檫@些型號(hào)提供了鈦寶石激光器中的長(zhǎng)波長(zhǎng)直接調(diào)諧范圍。 “這為我們的合作者提供了全面的激發(fā)波長(zhǎng)，包括用于自發(fā)熒光的 800 nm、用于綠色（和青色）熒光蛋白的 900 nm，以及用于 mfruit 系列紅色熒光蛋白的 1040 nm。長(zhǎng)波長(zhǎng)也有助于在較長(zhǎng)采集時(shí)間的活體組織實(shí)驗(yàn)中最大限度減少自發(fā)熒光和光損傷。”

圖 2.“T 細(xì)胞抗原識(shí)別”的體內(nèi)雙光子成像揭示了隨機(jī) T 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)在啟動(dòng)適應(yīng)性過(guò)程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用免疫反應(yīng)。頸部淋巴結(jié)中的 T 細(xì)胞（紅色）從高內(nèi)皮小靜脈（粉紅色）遷移出來(lái)并隨機(jī)接觸樹(shù)突狀細(xì)胞（綠色，放大視圖）。

Miller 博士指出，創(chuàng)新性的售后服務(wù)是他選擇這種激光器的另一個(gè)關(guān)鍵因素。 “當(dāng)我們激光器遇到問(wèn)題的時(shí)候，Coherent 立即幫助我們將激光器恢復(fù)到了 100% 的新機(jī)性能，僅有的停機(jī)時(shí)間實(shí)際上只是將替換激光器運(yùn)送到我實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間。”雖然他對(duì) Vision II 激光器非常放心，但他解釋說(shuō)合同仍然提供“安心”的售后服務(wù)體驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)可以不間斷運(yùn)行。

成果

Miller 博士表示，雙激光器顯微鏡在性能、可靠性和操作簡(jiǎn)便性方面取得了巨大成功，新用戶通常只需幾個(gè)小時(shí)的實(shí)踐培訓(xùn)就可以操作該系統(tǒng)。這一儀器幫助科研人員在幾十種不同主題的出版物上發(fā)表了數(shù)據(jù)。Miller 博士在 YouTube 上發(fā)布了一個(gè)令人印象深刻的演示文稿，其中包括大量圖像和視頻，這些圖像和視頻記錄了他使用活體多光子成像方法的長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.

Miller MJ, Wei SH, Parker I, Cahalan MD. Science. 2002 Jun 7;296(5574):1869-73. doi: 10.1126/science.1070051. Epub 2002 May 16.

T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Miller MJ, Hejazi AS, Wei SH, Cahalan MD, Parker I. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 27;101(4):998-1003. doi: 10.1073/pnas.0306407101. Epub 2004 Jan 13.

Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.

Miller MJ, Safrina O, Parker I, Cahalan MD. J Exp Med. 2004 Oct 4;200(7):847-56. doi: 10.1084/jem.20041236.

Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.

Zinselmeyer BH, Dempster J, Wokosin DL, Cannon JJ, Pless R, Parker I, Miller MJ.

Methods Enzymol. 2009;461:349-78. doi: 10.1016/S0076-6879(09)05416-0.

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